Francisco J. BARRANTES
Investigador Superior del CONICET (Emérito 2018). Fue director del grupo de Biomembranas. Fue director del INIBIBB durante más de 25 años y el primer director del CONICET-Bahía Blanca. Dirige el Laboratorio de Neurobiología Molecular del BIOMED, Instituto de Investigaciones Biomédicas UCA-CONICET.
Cartografía molecular y dinámica del receptor de acetilcolina obtenidas mediante microscopías ópticas de superresolución
Resumen
Muchas de las propiedades funcionales delos receptores de neurotransmisores, como el receptor de la acetilcolinanicotínico (nAChR), son moduladas por el microambiente lipídico (Barrantes, 2004, 2023). Así, el reconocimiento del ligando, la permeabilidad iónica, el tráfico a la superficie celular, la distribución y la movilidad en la membrana y la endocitosis, son finamente reguladas por los lípidos de su microentorno, y en particular por el colesterol, un lípido neutro (Barrantes, 2023, 2024).
En las últimas décadas hemos investigado la interacción del nAChR con los lípidos y en particular con el colesterol mediante una combinación de enfoques bioquímicos, biofísicos, electrofisiológicos, y de biología celular y molecular (ver revisiones en Barrantes 2022a,b; 2023). Estos estudios han involucradola construcción de modelos celulares de expresión de los receptores en células clonales de mamíferos, en algunos casos con defectos en el metabolismo lipídico, el estudio de la co-evolución de los receptores junto con la aparición de la biosíntesis de esteroles en el curso de millones de años (Barrantes, 2015; Barrantes & Fantini, 2016),y estudios moleculares mediante microscopías ópticas de superresolución para caracterizar la “cartografía” macromolecular del receptor en la superficie de la célula.
En colaboración con el grupo del Prof. Stefan Hell, quien desarrollara la técnica conocida como microscopía de STED (“stimulated total emissiondepletion”), pudimos revelar la organización a escala nanométrica del nAChR de tipo muscular por debajo del límite de resolución del microscopio óptico (Kellner et al., 2007). Con microscopía convencional o confocal había sido posible observar acúmulos (“clusters”) de AChRs bajo la forma de puntos de ~0.2 µm de diámetro. La microscopía STED nos permitió observar que estos acúmulos estaban constituídos por agregados moleculares de dimensiones nanoscópicas (“nanoclusters”) con un diámetro promedio de ~55 nm.Utilizando especímenes marcados con la misma sonda fluorescente (α-bungarotoxina Alexa Fluor 647N), pudimos correlacionar las imágenes obtenidas con dos microscopías basadas en principios físicos diferentes: microscopía STED y microscopía de molécula única STORM (stochasticopticalrecontructionmicroscopy), vinculando de este modo el nivel de molécula individual con la meso-escala de la organización del receptor en nano-agregados supramoleculares (Saavedra et al., 2022).
La topografía estática brindada por estas microscopías se enriquecíó mediante el estudio de las trayectorias moleculares del nAChR marcado con la bungarotoxina (ligando monovalente, antagonista) (Almarza et al, 2014; Barrantes, 2014; Mosqueira et al., 2018) o anticuerpo (ligando polivalente que entrecruza al receptor) (Mosqueira et al., 2020) utilizando microscopía STORM ysingle-particle tracking (SPT). Observamos que las trayectorias de moléculas individuales se interrumpen en forma transiente por períodos de confinamiento del orden de milisegundos, para luego continuar su movimiento en el plano de la membrana. Pudimos establecer que la proporción entre los períodos de confinamiento e inmobilizacióntransiente vs. los períodos de desplazamiento libre determina a nivel poblacional la dinámica traslacional del nAChR: difusión anómala (subdifusiva y ocasionalmente superdifusiva) y Browniana, es decir, cubriendo un amplio y heterogéneo espectro de regímenes difusionales. Comprobamos experimentalmente que el colesterol modula la dinámica traslacional del nAChR(Mosqueira et al., 2018, 2020; revisiones en Barrantes, 2022, 2024).
El análisis de la difusión del receptor en término de modelos físicos permitió deducir que un modelo de dos estados (libre ó confinado) era el más apropiado para explicar la dinámica de difusión del nAChR: libre difusión Browniana versus inmobilizacióntransiente en zonas de confinamiento con barreras permeables de ~35 nm de radio por lapsos de ms (Mosqueira et al., 2020). La formación y disolución de los nanoagregados (“nanoclusters”) ocurre en áreas más grandes (r = 120-180 nm) dependientes del colesterol, sugiriendo la participación de plataformas lipídicas y/o la red de actina subcortical.
Los resultados experimentales proveen una base sólida para entender en términos moleculares la importancia de la difusión traslacional del receptor de acetilcolina y la formación de nano-agregados en la sinaptogénesis y las alteraciones asociadas con la movilidad del receptor en enfermedades de la unión neuromuscular, así como la modulación directa e indirecta que ejercen los lípidos sobre los receptores de membrana (Barrantes, 2024).